Метод визуальной диагностики
В большинстве случаев определить вирусную природу болезни не трудно. Обычно ее определяют по внешним признакам, таким как линейные хлоротичные узоры или кольцевые узоры на молодых листьях. Однако, их идентификация часто затруднена, так как вирусы имеют бессимптомный (латентный) характер развития. Симптоматика зависит от состояния организма, агрессивности штамма патогена, внешних условий и продолжительности пребывания вируса или вироида в клетках хозяина. Например, симптомы заболевания отчетливо выражены у растений, росших на ярком свету и при умеренной температуре, при высокой температуре и недостаточном освещении симптоматика заболевания может быть совсем не выражена.
Посветление жилок самых молодых листьев нередко является одним из первых признаков системной вирусной инфекции. Жилки становятся жёлтыми и полупрозрачными. Листья, образующиеся позже, могут быть мозаичными, крапчатыми или совсем жёлтыми (хлоротичными).
Инкубационный период заболевания зависит от вида вируса, растения-хозяина и условий среды, но в любом случае он составляет несколько дней или недель.
Если первые симптомы вироза заметны на рассаде, то источник инфекции находился либо в семенах, либо заражение произошло при посредстве переносчика. Если заражённые растения расположены в культуре совершенно случайно или же только в рядках, посаженных из одной партии, то это говорит о том, что, скорее всего, был заражен посадочный материал. Если на отдельных участках поля обнаруживаются заболевшие растения, причём появление заражённых участков связано с почвенными различиями, имеются все основания предполагать распространение вирусов через почву.
Следует отметить также, что существуют симптомы, свойственные вирозам, но вызванные другими причинами (поражения фитоплазмами, некоторыми бактериями и сосущими вредителями). К появлению симптомов, сходных с вирусной инфекцией, часто приводят нарушения минерального питания, например, связанные с дефицитом железа (рис. 1). Различные деформации органов могут вызывать регуляторы роста и гербициды различной природы (рис. 2).
Таким образом, при помощи метода визуальной диагностики, точной идентификации по внешним признакам поражения вирусами и вироидами невозможна, однозначный ответ может быть получен только с использованием инструментальных методов (иммуноферментный анализ, ПЦР-анализ и т. д. ).
Метод индикаторный растений
Метод индикаторных растений — является очень распространенным методом диагностики вирусных и вироидных болезней и идентификации их возбудителей. В основу метода индикаторных растений положено использование растений-индикаторов, которые, в большинстве случаев дают четкие и специфичные симптомы, характерные для определённого вида патогена. Травянистые растения-индикаторы заражают механической инокуляцией соком, в результате заражение может проявляться в виде местных некрозов, изменением окраски и угнетением роста.
Для вируса аспермии томата в качестве индикатора используют молодые растения табака (Nicotiana glutinosa), для диагностики Х-вируса картофеля — амарант шаровидный (Gomphrena globosa). Для выявления заражённости томата вироидом веретеновидности клубней картофеля в качестве индикаторов используют скополию (Scopolia sinensis) или чувствительные сорта томата. В ряде случаев для заражения можно использовать отдельные изолированные листья растений-индикаторов. Соконепереносимые вирусы прививают на индикаторные растения различными методами. В редких случаях, чтобы для передачи вируса используют насекомых-преносчиков и растение-паразит повилику.
Серологически метод диагностики
Метод основан на реакции преципитации (образование осадка) между специфичными антителами и белками (антигенами) возбудителя заболевания. Метод серологической диагностики неприменим для идентификации вироидов из-за отсутствия белкового компонента, а также для ряда соконепереносимых вирусов со слабыми иммуногенными свойствами. Для идентификации вирусов в растении могут использоваться следующие модификации серологической диагностики:
1) Иммуноферментный анализ (ИФА) — наиболее высокочувствительный метод, который позволяет получать количественные оценки. В его основе лежит специфическое распознавание поверхностных антигенов вируса антителами, в присутствии ферментов. Данный метод широко используется на практике для идентификации вирусов сельскохозяйственных культур, подходит для серийных анализов.
2) Капельный метод. Проводится следующим образом. На предметном стекле каплю сока растения смешивают с каплей антисыворотки. Через пару минут проводят оценку реакции под микроскопом при малом увеличении в темном поле или даже визуально, без микроскопа.
3) Метод двойной диффузии — проводится в агаровом геле, для определения сферических и других мелких вирусов. Проводится по такой методике, в одни лунки, которые вырезаны в слое агаровой среды, добавляют антисыворотку, а в другие – очищенный сок растения. В геле вирусные частицы и антитела дифундируют друг другу на встречу, и в месте встречи образуют отчетливые линии преципитации в случае их комплиментарной специфичности.
4) Метод радиальной иммунодиффузии. При использовании данного метода антисыворотку добавляют непосредственно в агаровую среду, при этом лунки заполняют соком растений. Реакция является положительной, если вокруг лунок образуются преципитаны в форме колец.
5) Метод адсорбции. Метод основан на том, что перед реакцией с антигеном антитела связывают каким-либо инертным материалом с крупными частицами, например, латексом. При реакции с антигеном происходит хорошо заметная агглютинация всего комплекса.
Метод электронной микроскопии
На ультратонких срезах пораженных тканей растений, при помощи электронных микроскопов можно определить строение, форму и даже размеры вирусов или вироидов. Электронный микроскоп нередко используют в сочетании с серологическими методами (иммуноэлектронная микроскопия), при этом можно обнаруживать вирусные частицы с наслоившимися антителами. Метод электронной микроскопии используется крайне редко из-за высокой стоимости оборудования и реактивов, сложности выделения вирусов и вироидов, окисления срезов растений и ряда других факторов.
Метод электрофореза
Этот метод основан на разделении предварительно очищенных нуклеиновых кислот вируса (вироида) или его белков в геле под действием электрического тока, с последующим окрашиванием зон. Метод электрофореза позволяет определить массу и размеры вирусных или вироидных структур. Метод широко используют для визуального исследования конечного продукта полимеразной цепной реакции. Для регистрации полученных результатов делают фотографии геля в проходящем или отражённом свете.
Молекулярно-биологические методы основаны на знании строения молекулы РНК (ДНК) вируса или вироида. Наиболее распространённым тестом является амплификация (умножение) видоспецифичных последовательностей РНК в ходе полимеразной цепной реакции (ПЦР). Выделенные из исследуемых растений отдельные фрагменты РНК, специфичные только для одного вида или рода вирусов, многократно умножают с помощью ферментов в присутствии праймеров (соответствующих олигонуклеотидов). При этом их количество в конечном продукте реакции превышает исходное число копий выбранного фрагмента РНК в миллионы раз. Далее вирусные РНК (ДНК) обнаруживают методом электрофореза в геле или методом иммунофлуоресценции. Метод получает широкое распространение в практических вирусологических работах.
Метод ДНК-зондов также основан на принципе комплиментарности нуклеиновых кислот. Синтезируют специфичные зонды, которые гибридизуются только с определёнными нуклеотидными последовательностями РНК вируса или вироида. В зависимости от выбора зондов можно дифференцировать группы, виды и даже штаммы вирусов и вироидов.
Метод включений
В последствии развития вирусов, в клетках растений образуются скопления вирусных частиц, (включений), называемых кристаллами Ивановского, которые видны с помощью обычного светового микроскопа. Каждый вирус имеет свою форму вирусных включений, которые образуются, чаще всего, в клетках эпидермиса листьев или в клетках волосков. Например, вирус табачной мозаики имеет гексагональные и игловидные кристалы; Х-вирус картофеля типично образование сферических аморфных тел. Для выявления вируса зелёной крапчатой мозаики огурца, скручивания листьев картофеля и некоторых других применяют химические аналитические методы диагностики.
